芬戈莫德联合骨髓间充质干细胞移植脑创伤大鼠记忆功能的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：单纯骨髓间充质干细胞移植对脑损伤的修复作用并不理想，需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植同时应用芬戈莫德免疫抑制剂对脑损伤大鼠记忆功能恢复的影响。
方法：选取健康SD大鼠60只，采用液压颅脑损伤仪，给予253.312 5-303.975 kPa峰值的液压冲击力，制成重型液压颅脑损伤模型，随机分成为脑损伤组、骨髓间充质干细胞移植组、芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组。PKH-26标记的骨髓间充质干细胞移植后21-28 d进行Morris水迷宫试验。脑损伤4周后取脑组织行PKH-26免疫荧光、苏木精-伊红染色。
结果与结论：移植后4周，各组平均潜伏时间均逐渐缩短，芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组平均潜伏时间较骨髓间充质干细胞移植组缩短(P < 0.05)，较脑损伤组明显缩短(P < 0.01)。芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组穿越平台次数及目标象限游泳距离与总距离百分比均高于脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组(P < 0.05)。芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组PKH-26阳性细胞明显高于脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组 (P < 0.05)。结果可见骨髓间充质干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的记忆功能，联合应用芬戈莫德免疫抑制剂有协同效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 干细胞移植, 骨髓间充质干细胞, 脑损伤, 移植, 芬戈莫德

Abstract:

BACKGROUND: The repair effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on brain injury were not ideal. Combined therapy with medicine and biological engineering materials is needed.
OBJECTIVE: To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation and fingolimod immunosuppressants on memory function recovery in rats with brain injury.
METHODS: A total of 60 healthy Sprague-Dawley rats were subjected to hydraulic shock with peak value of 253.312 5–303.975 kPa with a hydraulic head injury instrument so as to induce a model of severe hydraulic head injury. They were randomly divided into brain injury group, bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group and fingolimod + bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group. The Morris water maze test was tested at 21–28 days after PKH-26-labeled bone marrow mesenchymal stem cell transplantation. The PKH-26 immunofluorescence and hematoxylin-eosin staining were conducted in brain tissues at 4 weeks after brain injury.
RESULTS AND CONCLUSION: At 4 weeks after transplantation, the average escape latency was gradually decreased in each group. The average escape latency was shorter in the fingolimod + bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group than in the bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group (P < 0.05), and significantly shorter than in the brain injury group (P < 0.01). The number of times of crossing the platform and the percentage of swimming distance to total distance were higher in the fingolimod + bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group than in the brain injury group and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group (P < 0.05). The number of PKH-26-positive cells was significantly higher in the fingolimod + bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group than in the brain injury group and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group (P < 0.05). Results confirmed that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation could apparently improve memory function of rats with severe brain injury. The combined application of fingolimod immunosuppressants has synergistic effects.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, brain injuries, immunosuppressive agents

中图分类号:

R394.2

王成. 芬戈莫德联合骨髓间充质干细胞移植脑创伤大鼠记忆功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4469-4473.

Wang Cheng. Changes in memory function of rats with brain injury after fingolimod administration combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4469-4473.

图/表（结果） 4

2.1 骨髓间充质干细胞形态观察培养3 d时细胞数量较少，散在分布，细胞呈长梭形或多角形；培养四五天后，细胞逐渐呈贴壁性生长；培养八九天，细胞铺满培养瓶底面，呈团簇集落样生长。流式细胞仪检测结果显示CD34、CD29、CD45、CD105、CD90及CD49阳性。第3代骨髓间充质干细胞均一性较好，纯度达96%以上，见图1。

2.2 Morris水迷宫检测结果

空间定航实验：各组大鼠平均潜伏时间逐渐缩短，第1天时各组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，第2天时芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组逃避潜伏期较脑损伤组、骨髓间充质干细胞组明显缩短(P < 0.05)，第3-5天时芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组逃避潜伏期较脑损伤组缩短更明显(P < 0.01)，见表1。

空间探索实验：与芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组相比，骨髓间充质干细胞组和脑损伤组穿越原平台次数明显减少，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)；与芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组相比，骨髓间充质干细胞组和脑损伤组目标象限游泳时间占总时间的百分比明显减少(P < 0.05，P < 0.011)，见表1。

2.3　苏木精-伊红染色和PKH26免疫荧光移植4周后苏木精-伊红染色，脑损伤组损伤处脑组织形成胶质瘢痕，局部可见脑萎缩及软化灶形成(图2A)。骨髓间充质干细胞组移植部位组织瘢痕及软化灶均小于脑损伤组，而大于芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组(图2B)。芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组软化灶消失，有可见少量瘢痕(图2C)。

切片中可见散在的PKH26染色阳性的红色荧光：脑损伤组为(0.00±0.00)个/高倍视野(图3A)；骨髓间充质干细胞组为(33.43±6.54)个/高倍视野(图3B)；芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组为(71.34±8.34)个/高倍视野(图3C)。经方差分析后，两组之间比较采用Dunnett-t 检验，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：2010年9月至2011年9月在天津医科大学神经病学研究所完成相关实验。

材料：

实验动物：清洁级Sprague-Dawley大鼠68只，体质量(260±15) g，雌雄各半，购自中国医学科学院动物实验室，动物质量合格证号为SCXK20060013。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养与收集：通过密度梯度离心联合贴壁法分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，原代培养达80%以上融合后，按1∶3传代培养，取生长良好的1-3代大鼠骨髓间充质干细胞，用25%胰蛋白酶室温消化 5 min，以含体积分数为5%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，磷酸盐缓冲液清洗，1 000 r/min离心5 min，取第3代或4代细胞用于移植实验。

建立动物模型及分组：清洁级SD大鼠通过10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉满意后，按重型颅脑损伤的国际通用标准，使用液压颅脑损伤仪，各组大鼠给予253.312 5- 303.975 kPa峰值的冲击压力，制成重型大鼠颅脑损伤模型^[9]。造模时出现自主呼吸暂停的大鼠，立即通过小动物呼吸机行面罩吸氧。共打击68只大鼠，打击后即刻死亡4只，伤后第2天死亡4只，余60只通过随机数据表法分为3组，每组20只。脑损伤后72 h将大鼠再次麻醉后，打开原骨窗，通过5 μL的微量注射器进行立体定向移植。①脑损伤组：向大鼠骨窗边缘分三点向脑组织内注入3 μL不含骨髓间充质干细胞的细胞培养液(每点1 μL，深度为硬膜下3.0 mm，留针10 min，缓慢退针后缝合大鼠头皮)。②骨髓间充质干细胞移植组：同样方式向大鼠脑组织内注射骨髓间充质干细胞悬液3 μL(2×10⁵ L^-¹)。③芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组：同样方式向大鼠脑组织内注入骨髓间充质干细胞悬液3 μL(2×10⁵ L^-¹)，在伤后30 min腹腔注射 1次芬戈莫德 0.5 mg/kg。损伤组以相同方法给予生理盐水。4 h后再注射1次，共2次^[10]；各组大鼠腹腔注射庆大霉素2 000 U抗感染治疗后回笼饲养。

Morris水迷宫结果：各组大鼠在颅脑损伤后23-28 d通过Morris水迷宫检测大鼠学习和记忆能力^[11]。空间定航实验检测如下：历时5.5 d，记录各只大鼠入水至找到并爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期。空间探索实验检测如下：于第5天下午撤掉平台，大鼠在Morris迷宫内自由活动2 min，记录各大鼠经过平台原址的次数。

苏木精-伊红染色及PKH-26荧光显微镜观察：伤后4周，各组大鼠随机取6只，麻醉处死，取损伤处脑组织， 40 g/L多聚甲醛固定后，行常规冰冻切片，苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察。每张切片于高倍镜(×200)下任取10个视野，计算每个视野中PKH-26 阳性细胞个数，取均值作为各组PKH-26阳性细胞数。

主要观察指标：①Morris水迷宫检测结果。②损伤处脑组织病理形态学变化以及PKH-26阳性细胞数。

统计学分析：用SAS 8.0软件对实验数据进行统计分析。所得数据以x(_)±s表示，采用重复测量方差分析和t 检验进行统计学分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

创伤性脑损伤是神经外科常见疾病之一。损伤后患者的病情危重、变化快、死亡率高、并发症多，对患者的中枢神经系统造成严重伤害，如何提高预后一直是神经外科医生的一大难题。传统观点认为中枢神经系统损伤后是不可再生的，因此颅脑损伤后的中枢神经修复一直是医学界研究的重点。近几年来，相关研究结果显示：干细胞具有较强的增殖和分化能力(如骨髓间充质干细胞可向神经细胞分化已逐渐引起人们的重视)，且在颅脑创伤修复方面发挥了重要的临床应用价值^[12]。近年来研究表明，细胞移植对治疗创伤性脑损伤有显著疗效，骨髓间充质干细胞是一种具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，其具有来源比较广泛、易于采集、保存、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。有研究显示骨髓间充质干细胞能够顺利分离和体外扩增，其在间充质干细胞专用培养基中长势良好，通过传代可以获得丰富的干细胞来源^[13-23]。骨髓间充质干细胞移植治疗神经系统损伤的作用机制可能有：可分化为神经元标志的细胞，代替脑损伤区坏死神经细胞，进而同宿主的神经细胞建立突触联系参与宿主神经功能的重建^[24-33]。营养支持和神经保护作用，骨髓间充质干细胞能分泌神经生长因子、集落刺激因子、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及白细胞介素等，这些细胞对神经功能的恢复发挥重要的作用，促进了神经电传导功能的重建。但是单纯骨髓间充质干细胞移植对颅脑损伤的修复作用并不十分理想，仍需要结合药物、物理及生物工程材料等手段进行综合治疗^[34-37]。

芬戈莫德是近年来研究发现的一种来源于冬虫夏草的新型免疫抑制剂。与传统免疫抑制剂不同，芬戈莫德的作用机制与淋巴细胞激活信号无关，而是以影响淋巴细胞定居和迁徙为主。Miron等的体外研究表明，芬戈莫德可明显减少外周血淋巴细胞的数目^[38-40]，尤可以使CD4⁺T淋巴细胞数目在3 h内迅速降低，通过调节淋巴细胞对趋化因子的反应性，达到加快淋巴细胞的归巢，能够抑制活化的淋巴细胞对移植物或炎症组织造成浸润从而起到抑制损伤部位炎症反应、促进损伤的修复，保护机体组织或移植器官。芬戈莫德也是第一个S1P受体激动剂类药，它功能强大、作用可逆、给药方便，具有更强的免疫抑制活性和更低的毒性，具有广阔的应用前景^[41-43]。本研究表明，移植后4周，各组平均潜伏时间均逐渐缩短，芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组平均潜伏时间较骨髓间充质干细胞移植组缩短(P < 0.05)，较脑损伤组明显缩短(P < 0.01)。芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组穿越平台次数及目标象限游泳距离与总距离百分比均高于脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组(P < 0.05)。芬戈莫德+骨髓间充质干细胞移植组PKH-26阳性细胞数明显高于对照组和骨髓间充质干细胞移植组(P < 0.05)。总之，芬戈莫德免疫抑制剂治疗联合立体定向移植骨髓间充质干细胞能够有效地提高细胞移植对脑损伤的治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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